Relatie tussen grondbemonstering en partijbesmettingen voor Meloïdogyne

03/05/2011 - J. Doornbos, J. Luimes, T.H. Been, A.W.W. v. Gastel en G.W. Korthals - NAK AGRO, PRI en PPO-agv

Waar gaat dit over?

Het project 'Opsporingsmethoden Meloidogyne in pootaardappelen' is opgezet vanuit het Actieplan Aaltjesbeheersing en bestaat uit drie onderdelen. In het onderdeel 'Relatie tussen grondbemonstering en partijbesmetting voor Meloidogyne' wordt een onderzoek uitgevoerd naar de relatie tussen een grondbemonstering voorafgaand aan de teelt van aardappelen en de mate van besmetting van het uiteindelijke product: de aardappelen. Hierbij worden zowel vooraf (grondbemonstering) als achteraf (partijonderzoek) verschillende methodieken met elkaar vergeleken.

Grondbemonstering (vooraf) is niet slechter dan de gangbare partijbemonstering (achteraf), maar kan het risico op afkeuring van pootgoed na de teelt eerder signaleren.
Numeriek is de PCR-methode het meest succesvol. De PCR-methode blijkt significant beter dan de VLA standaard bemonsteringsmethode en de graaddagentoets. Er kan echter geen significant verschil worden aangetoond tussen PCR en de extra VLA bemonsteringsmethode. De graaddagentoets is net zo goed als de standaard VLA bemonsteringsmethode.

Inleiding

Probleemstelling

Meloidogyne chitwoodi (maïswortelknobbelaaltje) behoort tot de zogenaamde wortelknobbelaaltjes. Deze aaltjes veroorzaken schade in verschillende gewassen, zoals aardappel, bieten, erwten, peen en schorseneer. De schade kan zeer groot zijn.
Naast opbrengst- en kwaliteitsderving is Meloidogyne chitwoodi een quarantaineorganisme. Dit betekent dat vermeerderingsmateriaal, zoals pootaardappelen en bloembollen, vrij moet zijn van Meloidogyne chitwoodi. Indien dit aaltje in een partij wordt aangetroffen, verliest de partij de pootgoedstatus. Daarnaast wordt het bedrijf een uitgebreid controleregime opgelegd en wordt in de jaren daarna binnen een straal van 1 km het vermeerderingsmateriaal verplicht getoetst op dit organisme. De gevolgen voor de sector kunnen groot zijn. Enerzijds omdat een partij pootgoed meer oplevert dan een partij consumptieaardappelen, anderzijds omdat het imago van Nederland als exporteur van hoogwaardig vermeerderingsmateriaal in het geding kan komen.
Het aaltje is met de huidige technieken lastig te detecteren, waardoor zowel het nemen van maatregelen voor controle, de preventie van verspreiding, als het inzicht in de financiële risico’s die de teler neemt worden belemmerd.

Doelstelling

Doel van dit onderzoek is om na te gaan of een bemonstering uitgevoerd vóór de teelt van aardappelen betrouwbare informatie verschaft over de aan- of afwezigheid van het aaltje en de risico’s op partijbesmettingen. Een bedrijfszekere bemonstering garandeert een goed perceel keuze waarmee telers een afkeuring van partijen door een voorgeschreven partijonderzoek kunnen minimaliseren of voorkomen.

Onderzoek

Keuze percelen

De keuze van de percelen is gemaakt op basis van twee situaties, namelijk:

  1. Bedrijven liggend in de cirkelgebieden 2007;
  2. Verdeeld over meerdere gebieden in Nederland.

Door NAK AGRO zijn in deze regio’s telers benaderd met vraag of zij percelen hebben met poot- of consumptieaardappelen in 2008. Deelname aan het project was op vrijwillige basis en zonder consequenties voor de telers. In onderstaande tabel zijn de aantallen percelen per gebied weergegeven waar de monstername van grond heeft plaats gevonden.

Tabel 1. Aantal bemonsterde percelen per gebied.
GebiedAantal percelen
Noord-Holland10
Noordoostpolder10
Zuidoost-Nederland10

Proefuitvoering

Binnen het project 'Opsporingsmethode Meloidogyne in pootaardappelen' zijn twee bemonsteringsmethodieken met elkaar vergeleken, waardoor er tweemaal een monstername van 1200 cc grond heeft plaatsgevonden op 1 hectare grond. Beide grondmonsters zijn gescheiden van elkaar gestoken.

Monstername van 2 x 1200 cc grond volgens de methode:
1) NAK AGRO standaard VLA (1200 cc/100 cc spoelen en 2 x 10 cc suspensie tellen)
2) NAK AGRO extra VLA (1200 cc/300 cc spoelen en 100 cc suspensie volledig tellen)

De grond is geanalyseerd op het laboratorium van Nederlandse Algemene Keuringsdienst (NAK) te Emmeloord. Op de percelen zijn aardappelen gepoot en voor het rooien zijn knolmonsters genomen voor bepaling van de knolaantasting. Het knolonderzoek is ook uitgevoerd op het laboratorium van de NAK. Het onderzoek is op twee verschillende manieren uitgevoerd, namelijk visueel (graaddagentoets) en met behulp van Polymerase Chain Reaction (PCR).

Bemonstering

Methode standaard VLA:
De grond is gestoken volgens bemonsteringsmethode 10. Hierbij wordt 2400 cc per 2 ha verzameld, volgens een raster met rasterbreedte variërend tussen 8 tot 11 meter en een rasterlengte variërend tussen 15 tot 21 meter. Dit resulteert in ca. 32 steken met een steekgrootte van ca. 40 cc (grondboor 1,2 cm 25 cm diep). Doordat dit onderzoek zich richtte op percelen met een oppervlak van 1 ha is, gebruik makend van de beschreven rasterdimensies, geen 2400 cc maar 1200 cc grond verzameld. De grond wordt zorgvuldig gemengd en uit het bulkmonster wordt een submonster genomen van 100 cc. Dit submonster wordt gespoeld en geïncubeerd. De grond wordt gedurende 14 dagen ter incubatie weggelegd. In onderstaande figuur is schematisch weergegeven hoe de monstername heeft plaats gevonden.

Figuur 1. Monstername van grondmonsters; bemonsteringsmethode 10: 2400 cc / 2 ha, raster: breed 8-11 meter, lengte 15-21 meter, steekgrootte 40 cc. Omdat in dit project 1 ha is bemonsterd, is de totale hoeveelheid grond 1200 cc.

Figuur1 - Relatie grondbemonstering en partijbesmettingen Meloidogyne

Methode extra VLA:
De grond is gestoken volgens bemonsteringsmethode 10. Dit is op dezelfde wijze uitgevoerd als bij de methode standaard VLA. Nu is echter uit het 1200 cc bulkmonster een sub monster van 300 cc verzameld. Dit grotere sub monster wordt op dezelfde manier verwerkt als beschreven bij de methode standaard VLA. De tellingen van de suspensie van de spoel- en incubatiemonsters verschillen wel ten opzichte van de standaard methode, omdat bij de methode extra VLA de volledige suspensie van 100 cc is geteld. Van beide methoden is de soortdeterminatie morfologisch uitgevoerd.
Na de teelt van aardappelen in 2008 is van de besmette percelen in het voorjaar (april tot eind mei) van 2009 opnieuw de besmetting in de grond bepaald (Pf 2008). Voor teeltjaar 2009 is op dezelfde wijze het grondonderzoek uitgevoerd.

Knolonderzoek

Vóór de oogst van de aardappelen zijn in augustus en september knolmonsters direct uit het bemonsterde perceelsgedeelte genomen. In teeltjaar 2008 is dat uitgevoerd op 30 percelen en in teeltjaar 2009 op 29 percelen.
Voor het knolonderzoek zijn, ongeveer één week voor de daadwerkelijke oogst, uit het bemonsterde oppervlak van 100 x 100 m 80 planten gerooid. Hiervoor is het bemonsterde perceelsgedeelte uitgemeten en gemarkeerd met piketten. Binnen deze oppervlakte is een randbuffer van 10 meter aangehouden waarbinnen de monsters zijn verzameld. De bemonstering is uitgevoerd volgens de N-methode. Vanaf de linkerzijde is naar achteren gemonsterd, daarna schuin naar de rechter voorhoek en vervolgens weer recht naar achteren, waarbij de totale monsterlengte ongeveer 310 meter bedraagt. Over deze afstand is om de vier meter de opbrengst van één gehele plant gerooid. In onderstaande figuur is schematisch weergegeven waar de knolmonsters uit de 1 ha (100 x 100 m) gehaald zijn.

Figuur 2. Monstername van knolmonsters.

Figuur 2 - Relatie grondbemonstering en partijbesmettingen Meloidogyne

Onderzoek 2008

Bij het oogsten van de knollen zijn er twee partijmonsters van 200 knollen (knolmaat 35-50 mm) van een perceel samengesteld. Na de oogst zijn de aardappelen bewaard bij 18 °C.
De twee knolmonsters zijn gecodeerd als monster A en B:

  • Monster A (200 knollen) is in december 2008 visueel onderzocht. Eén schil wordt op een willekeurige plaats van de knol gehaald en het snijvlak wordt beoordeeld op symptomen van het wortelknobbelaaltjes Meloidogyne chitwoodi en/of Meloidogyne fallax. Dit onderzoek, ook wel graaddagentoets genoemd, is uitgevoerd volgens PD-voorschrift.
  • Monster B (200 knollen) is in november 2008 onderzocht door middel van PCR. Het monster werd gesplitst in twee sub monsters van elk 100 knollen die apart werden geanalyseerd. Deze toets is uitgevoerd door de NAK. Van de aardappel is 1 schil verwijderd. Op dezelfde plek is de 2e schil gebruikt voor PCR onderzoek. De 100 schillen zijn samengevoegd tot 1 monster. Hiermee is de moleculaire bepaling uitgevoerd. Het PCR onderzoek is uitgevoerd op 2 x 100 knollen. De detectiekans van de uitgevoerde PCR toets is één eiprop in 100 knollen.

Onderzoek 2009

Ook bij het oogsten van de knollen in 2009 zijn twee monsters van een perceel genomen van 200 knollen in de knolmaat 35-50 mm. Deze twee monsters zijn gecodeerd als monster A en B en zijn in november 2009 onderzocht. Monster A is visueel onderzocht. Monster B is gesplitst in elk 100 knollen en door middel van PCR onderzocht.

Resultaten

Resultaten 2008

In onderstaande tabel worden de resultaten weergegeven van onderzoeksjaar 2008. In de kolom Grondonderzoek (jan 08) is het berekende aantal aaltjes per volume weergegeven. In de kolom 100 cc staan de resultaten van methode 1) NAK AGRO standaard VLA en in de kolom 300 cc staan de resultaten van methode 2) NAK AGRO extra VLA 1200/300 cc spoelen en 100 cc tellen. In de kolom Knolonderzoek (nov 08) worden de resultaten van het knolonderzoek, van zowel de visuele inspectie als van de twee PCR monsters, weergegeven. In de laatste kolom Grondonderzoek (mei 09) wordt de eindbesmetting volgens methode 1 en 2 weergegeven.

Tabel 2. Resultaten onderzoeksjaar 2008

Tabel 2
- = niet aantoonbaar besmet, No = niet onderzocht

Resultaten 2009

In tabel 3 worden de resultaten weergegeven van onderzoeksjaar 2009. In de kolom Grondonderzoek (mei 09) is het berekende aantal aaltjes per volume weergegeven. In de kolom 100 cc staan de resultaten van methode 1) NAK AGRO standaard VLA en in de kolom 300 cc staan de resultaten van methode 2) NAK AGRO extra VLA. In de kolom Knolonderzoek (nov 09) worden de resultaten van zowel de visuele inspectie als de twee PCR monsters weergegeven.

Tabel 3. Resultaten onderzoeksjaar 2009


- = niet aantoonbaar besmet, No = niet onderzocht

Conclusies, discussie en aanbevelingen

Conclusie en discussie

Grondbemonstering (vooraf) is niet slechter dan de gangbare partijbemonstering (achteraf), maar kan het risico op afkeuring van pootgoed na de teelt eerder signaleren.
Numeriek is de PCR-methode het meest succesvol met 19 van de 21 besmettingen aangetoond. De PCR-methode blijkt significant beter dan de VLA standaard bemonsteringsmethode en de graaddagentoets. Er kan overigens geen significant verschil worden aangetoond tussen PCR en de extra VLA bemonsteringsmethode.
De graaddagentoets is net zo goed als de standaard VLA bemonsteringsmethode.
Het PCR-knolonderzoek is wat betreft detectie significant beter dan de standaard VLA bemonstering. Van de 19 PCR-detecties zijn er 11 door de standaard VLA bemonsteringsmethode gedetecteerd.
De PCR-methode is ook significant beter dan de graaddagentoets. De PCR-toets is dus een goede vervanger van de graaddagentoets. Van de 19 PCR-detecties zijn er 13 ook door de graaddagentoets ontdekt.
Beide bemonsteringsmethoden kunnen onder de gegeven omstandigheden het risico van afkeuring van partijen in veel gevallen voorkomen. De extra VLA methode scoort beter dan de standaard VLA methode (75% van de PCR-detecties) en zal nog beter functioneren als deze wordt toegepast voor de vroegtijdige detectie van kleine besmettingshaarden. Beide methoden zouden beter hebben gepresteerd als het mogelijk was geweest de bemonsteringen in de juiste periode van 2008 uit te voeren.
Gezien het feit dat detectie vóór de teelt van pootgoed voor de teler de voorkeur heeft boven detectie met een graaddagentoets of PCR-toets na de teelt, blijft bemonstering vooraf de voorkeur hebben. Het is wel wenselijk om de bereikte betrouwbaarheid, vergelijkbaar met de graaddagentoets, verder op te hogen. Nieuw ontwikkelde grond bemonsterings- en onderzoeksmethoden kunnen het risico op partijafkeuring nog verder minimaliseren.
Verificatieonderzoek is langdurig onderzoek en is vooral relevant wanneer het onderzoek gericht is op bodem gebonden organismen. Ondanks de hier gerapporteerde twee jaar onderzoek is de uiteindelijke gegevensset nog redelijk beperkt. Daarnaast zijn in dit geval bijvoorbeeld de grootte van de aangetroffen besmettingen onbekend. Hierdoor staan er veel onbesmette percelen in de database; 38 percelen zijn niet besmet verklaard met welke methode dan ook. Deze percelen kunnen niet worden gebruikt om conclusies te trekken betreffende de kwaliteit van de gebruikte detectiemethoden.
De gegevens zijn nog eens weergegeven in tabel 4 en 5. Van de 59 bemonsterde percelen bleken er uiteindelijk 21 op enigerlei wijze aantoonbaar besmet. Hiervan konden 15 besmettingen op basis van grondbemonstering worden aangetoond. Van deze besmettingen konden er 10 met beide bemonsteringssystemen worden aangetoond. De standaard VLA bemonsteringsmethode leverde 1 besmetting op die niet werd aangetoond met de extra VLA methode. De NAK AGRO extra VLA methode leverde 4 besmettingen extra op die niet werden aangetoond met de standaard VLA methode. Vanwege het lage aantal dataparen (15) is er geen significant verschil in effectiviteit te berekenen tussen de beide bemonsteringsmethoden.

Tabel 4. Vergelijking bemonstering methoden en knolonderzoek. Aangegeven wordt het aantal aangetoonde besmettingen per methode, het aantal besmettingen dat door beide versies van een methode – bemonstering en knolonderzoek apart - is aangetoond en hoeveel extra percelen een methode oplevert ten opzichte van de andere (bemonstering en knolonderzoek apart)
20082009Totaal
Bemonsterde percelen302959
MethodeStandaard VLAExtra VLAVisueelPCRStandaard VLAExtra VLAVisueelPCRStandaard VLAExtra VLAVisueelPCR
Bij 1 methode aangetroffen78711466811141319
Bij beide methoden aangetroffen6677446610101313
Binnen de methode extra aangetroffen120402021406

Wanneer er wordt gekeken naar de waargenomen symptomen blijken er in totaal 13 besmettingen te worden aangetroffen; deze zijn ook (op twee na) door de standaard VLA bemonstering aangetoond, terwijl de extra VLA bemonstering er ook twee aantoont die niet via symptomen wordt teruggevonden.
Numeriek is de PCR-methode het meest succesvol met 19 van de 21 besmettingen aangetoond. De PCR-methode blijkt significant beter (P < 0.004) dan de VLA standaard bemonsteringsmethode en de graaddagentoets (P < 0.034). Geen significant verschil (P < 0.05 niveau) kan worden aangetoond tussen PCR en de extra VLA bemonsteringsmethode.

Tabel 5. Aantal aangetoonde besmettingen per toegepaste methode en het totaal aantal gedetecteerde Meloidogyne besmettingen.
Jaar20082009Totaal
Bemonsterde percelen302959
Percelen standaard VLA7411
Percelen extra VLA8614
Percelen visuele toets7613
Percelen PCR11819
Percelen gedetecteerd12921

Bemonstering blijkt even effectief als het achteraf testen van 200 knollen op externe symptomen. De kans op een vals negatieve uitslag lijkt in dit onderzoek voor de extra VLA methode even groot als het aantal vals negatieven voor de externe symptomen, maar dit is statistisch niet hard te maken. Duidelijk is dat grondbemonstering niet slechter is dan de gangbare partijbemonstering, maar wel het risico op afkeuring van pootgoed na de teelt sterk kan reduceren! Bovendien moet rekening worden gehouden met het feit dat de bemonsteringen voor het onderzoekjaar 2009 zeer laat zijn uitgevoerd, namelijk in mei 2009 i.p.v. in het najaar van 2008, waardoor de bemonsteringen minder effectief zijn als die uitgevoerd voor het onderzoek jaar 2008. Door de langere natuurlijke sterfte in het voorjaar zijn de detectiekansen veel lager en is het effect van beide bemonsteringsmethoden voor de detectie onderschat. De vertraging is veroorzaakt door de strenge winter van 2008.
Zelfs met de beperkte dataset blijkt de PCR-methode effectiever qua detectie dan alle andere methoden en heeft het grote voordelen t.o.v. het European Plant Protectie Organization (EPPO) protocol, o.a. qua tijdstip (onmiddellijk na de oogst) en de snelheid van de bepaling.
De herbemonstering in het voorjaar van 2009 van de in mei 2008 bemonsterde percelen laat zien dat alle besmettingen werden teruggevonden.

Aanbevelingen

Intussen zijn er op basis van dit en ander lopend onderzoek sterk verbeterde bemonsteringmethoden ontwikkeld voor M. chitwoodi: de zogenaamde Melo-intensieve detectiemethoden. Deze methodieken houden rekening met de natuurlijke afname van de M. chitwoodi-populatie in de wintermaanden en zijn specifiek bedoeld om, als voorbemonstering voor de teelt van pootaardappelen, het risico voor de teler op knolafkeuring na de teelt te minimaliseren. Om op eenduidige wijze de effectiviteit van een dergelijke methode ten opzichte van een knolonderzoeksmethode te testen, is het noodzakelijk deze methodieken te verifiëren op percelen met een bekende besmetting van M. chitwoodi. Hierbij kan, door de gebruikte methoden per perceel te herhalen, ook de betrouwbaarheid van elke geteste methode worden geschat.